Valós idejű RT-PCR alkalmazása a Covid-19-ben

Mi az a valós idejű RT – PCR?

Fluoreszcens gének hozzáadása a PCR reakciórendszerhez, fluoreszcencia-jel-felhalmozódás felhasználásával a teljes PCR-folyamat valósidejű monitorozására, majd az ismeretlen sablon egy standard görbén keresztüli meghatározása valósidejű fluoreszcencia kvantitatív PCR-technológiának, más néven valósidejű Q PCR-.

A PCR-amplifikáció elve megegyezik a szokásos PCR-eszköz módszerével, azzal a különbséggel, hogy a PCR-amplifikáció során hozzáadott primereket izotópokkal, fluoreszceinnel stb. Jelölik, és a primereket és fluoreszcens próbákat arra használják, hogy specifikusan kötődjenek a templáthoz amplifikációkor. ugyanakkor.

Az amplifikált eredményeket összegyűjtjük és továbbítják a számítógépes elemző és feldolgozó rendszerhez a fluoreszcencia jelgyűjtő rendszer valós idejű gyűjtőjelein keresztül, hogy mennyiségi valósidejű eredménykimenetet kapjanak.

A valós idejű RT – PCR az egyik legszélesebb körben alkalmazott laboratóriumi módszer a COVID-19 vírus kimutatására. Noha sok ország valós idejű RT-PCR-t használt más betegségek, például az Ebola-vírus és a Zika-vírus diagnosztizálására, sok országnak támogatásra van szüksége e módszer adaptálásához a COVID-19 vírushoz, valamint nemzeti vizsgálati kapacitásuk növeléséhez.

Hogyan működik a valósidejű RT – PCR a COVID-19 vírussal?

A mintát azokból a testnek a részeiből veszik, ahol a COVID-19 vírus összegyűlik, például egy ember orrából vagy torokából. A mintát több kémiai oldattal kezelik, amelyek olyan anyagokat távolítanak el, mint például fehérjék és zsírok, és amelyek csak a mintában lévő RNS-t extrahálják. Ez az extrahált RNS az ember saját genetikai anyagának és, ha van, a vírus RNS-ének keveréke.

Az RNS-t egy specifikus enzim felhasználásával reverz módon transzkripcióba állítják a DNS-re. A tudósok ezután további rövid DNS-fragmenseket adnak hozzá, amelyek komplementerülnek az átírt vírus-DNS specifikus részeivel. Ha a vírus egy mintában van, akkor ezek a fragmensek a vírus DNS célszekvenciáihoz kapcsolódnak. A hozzáadott genetikai fragmensek egy részét a DNS-szálak építésére használják az amplifikáció során, míg másokat a DNS felépítésére és a marker-címkék hozzáadására használják a szálakhoz, amelyeket azután használnak a vírus kimutatására.

Az elegyet ezután RT-PCR gépen helyezzük. A gép a keveréket melegítő és lehűtött hőmérsékleteken ciklikusan működik, és olyan specifikus kémiai reakciókat vált ki, amelyek új, azonos példányokat hoznak létre a vírus DNS célszekvenciáiban. A ciklust újra és újra megismételjük a vírus-DNS célszekcióinak másolásához. Mindegyik ciklus megduplázza az előző számot: két példány négyré válik, négy példány nyolcvá válik, és így tovább. A szokásos valós idejű RT – PCR beállítás általában 35 cikluson megy keresztül, ami azt jelenti, hogy a folyamat végére a mintában jelen lévő vírus minden szálából körülbelül 35 milliárd új másolat készül a vírus DNS szekcióiról. .

A vírusos DNS-szekciók új példányainak felépítésekor a marker-címkék a DNS-szálakhoz kapcsolódnak, majd fluoreszkáló festéket szabadítanak fel, amelyet a gép számítógépe mér, és valós időben jelenít meg a képernyőn. A számítógép minden ciklus után követi a mintában lévő fluoreszcencia mennyiségét. Ha egy bizonyos szintű fluoreszcenciát meghaladnak, ez megerősíti a vírus jelenlétét. A tudósok azt is figyelemmel kísérik, hogy hány ciklus szükséges ahhoz, hogy elérje ezt a szintet a fertőzés súlyosságának becsléséhez: minél kevesebb a ciklus, annál súlyosabb a vírusfertőzés.

Miért érdemes valós idejű RT – PCR-t használni?

A valós idejű RT – PCR technika nagyon érzékeny és specifikus, és mindössze három órán belül képes megbízható diagnózist szolgáltatni, bár a laboratóriumok átlagosan hat és nyolc óra között tartanak. A rendelkezésre álló vírusizolációs módszerekkel összehasonlítva a valós idejű RT – PCR szignifikánsan gyorsabb, és kisebb a szennyeződés vagy hibák esélye, mivel a teljes folyamat zárt csőben hajtható végre. Ez továbbra is a legpontosabb módszer a COVID-19 vírus kimutatására.

A valós idejű RT – PCR azonban nem használható a múltbeli fertőzések kimutatására, ami fontos a vírus kialakulásának és terjedésének megértésében, mivel a vírusok a testben csak egy meghatározott időtartamra vannak jelen. Más módszerekre van szükség a múltbeli fertőzések kimutatására, nyomon követésére és tanulmányozására, különösen azok, amelyek tünetek nélkül kialakultak és terjedtek.